肿瘤坏死因子（TNF）

1975年，Carswell等发现并命名了TNF:先用细菌内毒素处理小鼠，而后在小鼠的血清中发现一种物质会导致肿瘤坏死，并将其称为肿瘤坏死因子。1984年，Pennica等首先对人TNF-a的cDNA进行了成功克隆，并在大肠杆菌中得到了表达。1985年，Shalaby把肿瘤坏死因子分为TNF-α和TNF-β。肿瘤坏死因子( Tumor Necrosis Factor,TNF)是一种的具有抗肿瘤活性的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物活性。

大肠杆菌表达系统

原核表达系统是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的蛋白表达系统之一。近几十年，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善，被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。市面上的重组蛋白有30%是由大肠杆菌表达系统生产而来，是小分子细胞质蛋白或结构域表达的首选宿主。在大肠杆菌表达系统中表达的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大肠杆菌中表达出来，真核基因含有内含子，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA构建表达载体在大肠杆菌系统中表达。

应用方案

通过高压细胞破碎仪使物料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中经过特定宽度的限流缝隙均质区在均质阀内产生三种效应:空穴效应、撞击效应、剪切效应的机械作用力从而打破细胞壁的束缚，把蛋白质从组织或细胞中释放出来尽可能保持原来的天然状态，不丧失活性，达到高效率破碎细胞的效果。即使用高压匀浆破碎法采用高压细胞破碎法，在细胞内产生的压力效应，从而能够有效地提取出蛋白质，且处理量大、破碎速度较快。这是一种机械处理细胞，物理抽提方法。

解决方案

首先富集菌体，收集胞内产物的细胞或菌体。然后进行细胞重悬，用适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体（沉淀、细胞、活性物质等等）重新悬浮。其次进行细胞破碎，使产物转移到液相中。最后收集含生化物质的液相，进行碎片分离，分离除去细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和絮凝体等固体悬浮物，得到上清液或滤液。然后从澄清的滤液中提取胞内产物，从细胞裂解物中获取目标产物。

1、发酵罐培养：根据rmh-TNF的表达，使用单因素法对由rmh-TNF在大肠杆菌中表达时的诱导时机、诱导维持时间、pH值、溶解氧等进行了研究，选择出较好的发酵工艺参数。根据rmh-TNF代谢特点，通过对补料工艺的研究，确定了注射用重组改构人肿瘤坏死因子发酵罐发酵开始诱导后高温灭菌的补料培养基以流加的方式对发酵罐进行补加的新补料工艺。

2、发酵液离心：用高速离心的方法收集菌体，将放罐接口与管式分离机进液口连接，开启管式分离机冷冻水的供水阀门，开启管式分离机(16000 rpm),控制发酵液流速1.0-1.5L/min离心，上清液经专用管道排至自动灭活罐灭活后排弃。离心完毕后取出菌体。

3、菌体洗涤：将菌体混悬于TES溶液中，缓缓搅拌洗涤，用高速冷冻离心机，在4℃下，8000 rpm,离心20分钟。重复洗涤操作一次。湿菌体称重，-20℃冰箱保存。

4、菌体破碎：将菌体混悬，调节高压匀浆机泵马达进气阀门和出料管进气阀门使流出管压力在5000-20000 Psi范围内对菌体进行匀浆破碎得到细胞破碎液。

PhD优势

工程大肠杆菌HMS174菌种的全面检定，确认该重组菌rmh-TNF工程菌构建正确，目的蛋白占菌体总蛋白的百分含量大于30%，菌种保持稳定，菌种稳定性好，呈短棒状，无芽孢、支原体等微生物污染，革兰染色及生化检定呈典型的大肠杆菌特征，该菌适用于工程菌菌种库。

◆破壁能力：高压设计，轻松上压；均质效率高，工艺稳定；稳定的破碎能力，更高的胞内物提取；纯机械破碎，无化学污染；可放大工业化生产工艺设备

◆控温效果：独特温控设计，内置和外置双向控温，确保均质过程及出料温度可控。

◆活性保障：循环的控温系统，蛋白活性不失活，细胞破碎后，活性保值高达99%                                                                 

◆无菌保障：金属结构连接，没有O型圈或垫片，无死角设计；在线排空结构设计；所有机型均可实现在线清洗（CIP）、循环清洗、拆装清洗、在位灭菌（SIP）