PhD细胞破壁机-毕赤酵母破壁

应用背景

       毕赤酵母体系是真核体系中操作简单、成本低廉的系统，在蛋白加工、折叠、翻译后修饰等方面具有诸多优势，在毕赤酵母体系中蛋白转录后糖基化所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）非常接近高等真核生物的结构，活性几率大大高于原核体系。与其他表达系统的基因存在于游离质粒上不同，它的表达质粒是通过同源重组整合在基因组上的，转化简单（不需要病毒原液），表达菌株可以长时间保持（大于10年）而不失活。

应用难点

       胞内表达的优点是表达量高，糖基化程度很低或无糖基化，胞内表达的重组蛋白具有良好的活性和生物安全性，但是胞内表达需要对细胞进行破碎才可以收集产物，由于毕赤酵母细胞的细胞壁按结构划分为可分为三层，最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；上面的是一层糖蛋白；最外层是甘露聚糖，由1，6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。

应用方案

       通过高压细胞破碎仪使物料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中经过特定宽度的限流缝隙均质区在均质阀内产生三种效应:空穴效应、撞击效应、剪切效应的机械作用力从而打破细胞壁的束缚，把蛋白质从组织或细胞中释放出来尽可能保持原来的天然状态，不丧失活性，达到高效率破碎细胞的效果。即使用高压匀浆破碎法采用高压细胞破碎法，在细胞内产生的压力效应，从而能够有效地提取出蛋白质，且处理量大、破碎速度较快。这是一种机械处理细胞，物理抽提方法。

解决方案

       首先富集菌体，收集胞内产物的细胞或菌体。然后进行细胞重悬，用适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体（沉淀、细胞、活性物质等等）重新悬浮。其次进行细胞破碎，使产物转移到液相中。最后收集含生化物质的液相，进行碎片分离，分离除去细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和絮凝体等固体悬浮物，得到上清液或滤液。然后从澄清的滤液中提取胞内产物，从细胞裂解物中获取目标产物。

应用效果

       高压均质使酵母细胞破壁，酵母中更多的自溶物就更容易的释放到水环境中，进一步的抽提量也就增加。高压均质处理后酵母细胞壁破损使胞内物不再受细胞壁的限制，酶和底物的反应空间更加充足，反应产物的抑制作用减小，既增大了酶的活性，又保持酶的活力，还加快反应速度。酵母菌一般需要1300bar的压力破碎3-4遍，破碎率可以达到 90%以上，常见的典型应用：HPV疫苗、诺如病毒疫苗、乙肝疫苗、手足口病疫苗等。

技术工艺

破壁工艺：PhD高压均质处理

温控要求：10℃以内

破壁难点：菌浓较高，此菌液破壁条件未知

破壁结果：破壁得率客户认可